مقایسه پرایمرهای مختلف برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری

هلیکوباکتر پیلوری عامل اولیه ی گاستریت، زخم معده، زخم دئودنوم و سرطان معده می باشد. روش های مختلفی برای تشخیص عفونت helicobacter pylori وجود دارد که به دو دسته مهاجم و غیر مهاجم تقسیم می شوند. روش های غیر مهاجم شامل جستجوی آنتی بادی های سرمی، آنتی ژن مدفوعی، pcr مدفوعی و تست تنفسی اوره آز می باشند. هر یک از این تست ها دارای مزایا و معایبی هستند؛ اما روش هایی که دارای اختصاصیت بالا هستند به ویژه حائز اهمیت می باشند. هدف از این پژوهش طراحی یک واکنش pcr حساس و اختصاصی برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری در نمونه های گوناگون بیولوژیکی به ویژه مدفوع می باشد. طراحی واکنش شامل انتخاب برنامه ی مناسب و حتی الامکان کوتاه مدت برای pcr، شرایط واکنش به خصوص دمای اتصال پرایمر و طراحی پرایمر می باشد. در طراحی پرایمر اختصاصی بودن آن برای توالی هدف در ژن مربوطه و داشتن همولوژی نزدیک به 100% در اکثر سوش های h. pylori و در عین حال همولوژی بسیار پایین با سایر ژن ها و سایر باکتری ها به دقت مورد توجه قرار گرفته است. در واقع هدف اصلی ما در این پژوهش انتخاب روش و دستورکار ثابت برای انجام pcr بوده است که نه تنها ساده و ارزان باشد، بلکه بتواند به عنوان یک روش تشخیصی با حساسیت و ویژگی بالا برای تشخیص غیر تهاجمی h. pylori به کار رود. مصارف کاربردی چنین روشی شامل جستجوی این ارگانیسم در نمونه های غیر بیوپسی در مواردی است که عمل آندوسکپی یا مجاز نیست و یا مانند مورد کودکان مشکل بوده و دارای محدودیت است. در چنین مواردی می توان به ویژه از نمونه هایی مانند مدفوع برای تشخیص عفونت استفاده نمود. این هدف با مقایسه توالی های ژن هایی که به طور رایج در آزمایشگاه های گوناگون از جمله آزمایشگاه الزهرا استفاده شده و می شود با توالی های جدید تر یک ژن محافظت شده دنبال شد. در انتها طراحی یک یا چند جفت پرایمر pcr با اختصاصیت و حساسیت بالا بررسی خواهد شد؛ به نحوی که بتوان با کمک آن این ارگانیسم را در تمام نمونه های بیولوژیکی رد یابی کرد. در این پژوهش با هدف مقایسه نتایج pcr با چند جفت پرایمر، ژن های 16srna ،vaca وurec یا phosphoglucosamine mutase) glmm) انتخاب شدند. پرایمر های مختلف از این ژن های اختصاصی تهیه شده و در شرایط بهینه بررسی شدند. در مورد glmm سعی شد تا حساس ترین پرایمر انتخاب شود. لذا برای تکثیر این ژن چند جفت پرایمر طراحی و استفاده شد و بهترین آن ها به ویژه از نظر حساسیت انتخاب شد. در این پژوهش از توالی های حتی الامکان همولوگ حفاظت شده ی ژن urec (glmm) - که یک ژن housekeeping و حفاظت شده (conserved) می باشد- سه جفت پرایمر طراحی شد که این سه جفت پرایمر با پرایمر مطالعه ی espinoza و همکاران برای شناسایی 10 سویه ی h. pylori مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. واکنش pcr با تمام پرایمرهای سنتز شده در گرادیان های دمایی مختلف برای بدست آوردن بهترین باند pcr انجام شد. گرادیان غلظت dna نیز برای دو جفت پرایمر دارای نتایج مطلوب بررسی شد. علاوه بر پرایمرهای ژن glmm از یک جفت پرایمر برای هر یک از ژن های vaca(m)، vaca(s) و 16s rrna نیز استفاده شد و نتایج همه ی آنها با هم مقایسه و بررسی شد. دو روش pcr نیز شامل روش معمول و روش multiplex pcr مورد بررسی قرار گرفت. نتایج urec pcr با نتایج pcr ژن های vaca(m)، vaca(s) و 16s rrna مقایسه شدند. نتایج نشان دادند که دو جفت از پرایمر های urec طراحی شده در این پژوهش نسبت به سایرین حساسیت بالاتری داشتند. واکنش multiplex pcr برای این دو جفت پرایمر نتایج مطلوبی را حاصل نمود. هدف از طراحی واکنش multiplex با دو جفت پرایمر افزایش حساسیت و اختصاصیت واکنش با تشکیل دو محصول همزمان pcr بود. بنابراین روش و دستور کار مربوط به واکنش multiplex طراحی شده در این پژوهش می تواند برای تشخیص h. pylori در نمونه های مختلف استفاده شود.